5 Lipoksijenaz aktive edici protein FLAP inhibitörlerinin geliştirilmesi


Banoğlu E. (Yürütücü) , Çalışkan B.

TÜBİTAK Projesi, 2013 - 2016

  • Proje Türü: TÜBİTAK Projesi
  • Başlama Tarihi: Mart 2013
  • Bitiş Tarihi: Mart 2016

Proje Özeti

5-Lipoksijenaz (5-LO), araşidonik asitten (AA) lökotrien (LT) biyosentezinde ilk basamağı katalizleyen enzimdir. Bu basamak AA’in 5-LO enzimi tarafından kullanılabilmesine yardımcı bir protein, “5-LO aktive edici protein (FLAP)” varlığında gerçekleşir. LT’ler enflamatuvar ve alerjik hastalıkların patofizyolojisinde önemli rol oynayan mediyatörler olup, 5-LO yolağı ile sentezlenen LT’lerin ateroskleroz, kanser ve osteoporozda da önemli rol oynadığı gösterilmiştir. Bu sebeple, 5-LO enzimi ve/veya FLAP yardımcı proteinin inhibisyonu sonucu erken basamakta LT biyosentezinin engellenmesi gerçekleştirilerek özellikle astım gibi antilökotrien tedavi gerektiren hastalıklar için bu proteinler önemli birer ilaç hedefi haline gelmiştir. FLAP ve 5-LO proteinin kristal yapılarının 2011 ve 2007 yıllarında açıklanmış olması nedeniyle her iki protein için çok kısıtlı sayıda yapı aktivite çalışması mevcuttur. Bu bilgiler ışığında 5-LO ve FLAP proteinlerinin aktif bölgelerinin yapısal özelliklerinin anlaşılması ve etkin inhibitörlerin geliştirilmesi üzerine çalışmalarımız sırasında bu proje önerisi için temel araştırma safhasının tamamlandığı ön sonuçlara ulaşılmıştır (TÜBİTAK 108S210). Ön çalışmalarımızda benzimidazol ana yapısını taşıyan bir seri bileşik sentezi gerçekleştirilmiş ve FLAP inhibitör aktivite gösteren BRP-7 kodlu bileşik bu projedeki ileri çalışmaların temelini oluşturmak üzere öncü bileşik olarak seçilmiştir. BRP-7 bileşiği ile yapılan farmakolojik çalışmalarımız sonucunda bu bileşiğin saflaştırılmış 5-LO enzimini inhibe etmediği ancak bu enzimi barındıran insan lökositlerinde LT biyosentezini 0.31 μM IC50 değeri ile inhibe ettiği tespit edilmiştir (bu test sisteminde ticari olarak mevcut tek LT biyosentez inhibit.rü olan Zileuton için IC50 değeri 0.8 μM olarak bulunmuştur). FLAP inhibitörlerinin karakteristik özelliklerinden birisi 5-LO enziminin sitozolden nötrofilin perinükleer bölgesine translokasyonunu bloke etmesidir. Çalışmalarımız sonucu BRP-7’nin artan konsantrasyonlarda 5-LO enziminin nükleer membrana translokasyonunu inhibe ettiği tespit edilmiştir ve translokasyonun inhibisyonu 1 μM konsantrasyonda başlamıştır. Bunun yanında FLAP inhibitörleri için bir diğer karakteristik özellik artan AA konsantrasyonlarında inhibitor aktivitenin bozulmasıdır ki ortama ilave edilen 40 μM AA BRP-7’nin inhibitor aktivitesini engellemiştir. BRP-7 bileşiğinin AA metabolik yolağında ki diğer enzimler üzerinde inhibitor etkileri de araştırılmış, COX-1, COX-2 ve mPGES-1 enzimleri üzerinde 10-50 μM konsantrasyonlarda inhibitor etkisi gözlenmemiştir. BRP-7’nin in vivo olarak sıçanlarda akciğer zarı iltahabını önleyici etkisi “karragenan-ile-indüklenmiş pleurisy yöntemi” ile test edilmiş ve pleural kavitedeki eksuda volümünü % 33 oranında azalttığı tespit edilmiştir. Ayrıca pelural kavitedeki enflamatuvar hücre sayısını % 20 ve LTBmiktarını ise % 29 inhibe ettiği belirlenmiştir. Her ne kadar BRP-7'nin in vivo aktivitesi yüksek bulunmadıysa da, LTBoluşumu için spesifik etkisi dikkat çekicidir. Ayrıca BRP-7 için kardiyak toksisite biyomarker’ı olan hERG inhibisyonu test edilmiş ve 10 μM konsantrasyonda hERG inhibisyonu % 1’den az bulunmuştur. Bunun yanında ilaç etkileşimleri ve toksisite açısında önemli bir enzim olan CYP3A4 üzerindeki inhibitor etkisi 1-25 μM konsantrasyon aralığında test edilmiş ve BRP-7’nin bu enzimi inhibe etmediği gösterilmiştir. Böylece çalışmalarımız sonucu, selektif FLAP inhibit.rü olarak temel araştırma aşaması ve keşif fazını tamamlanmış olan BRP-7 .ncü bileşiği ön klinik çalışmalar için daha potent ilaç adayı geliştirmek amacıyla bu projenin başlangıç noktasını oluşturmak üzere seçilmiştir. Bu proje kapsamında BRP-7 bileşiğinin daha potent türevlerinin geliştirilmesi amacıyla kimyasal sentez, moleküler modelleme ve biyolojik aktivite test çalışmaları yürütülecek olup kurulacak yapı-etki ilişkileri sonucu FLAP inhibitor aktivitesi geliştirilmiş ilaç adayı olabilecek yeni türevlere ulaşılması planlanmaktadır. Ayrıca BRP-7'nin moleküler seviyede etki mekanizmasının aydınlatılması için farmakolojik çalışmalar yürütülecektir. Bir molekülün ilaç adayı olarak değerlendirilmesi için sadece hedeflenen aktivitesinin artması yeterli olmayıp, ayrıca yan etki profilinin iyileştirilmesi çalışmaları da gerekmektedir. Bu bakımdan günümüzde aktif bir molekülün ilaç adayı olarak ön klinik çalışmalara alınmadan once özellikle kardiyak toksisite için hERG (human Ether-à-go-go Related Gene) ve ilaç etkileşimleri için CYP450 enzim inhibisyonu çalışmalarının da yapılması öngörülmektedir. Bu sebeplerle öncü bileşiğin daha ileri geliştirilmesi ve daha potent türevlerin elde edilmesi için gerekli sentez çalışmaları ile yapı ile aktivite arasındaki ilişkinin anlaşılması, aktif türevlerin ilaç etkileşimleri açısından önemli sitokrom P450 (CYP3A4, 2C9, 2D6, 2C19, 1A2) izoformları üzerindeki inhibitör etkileri çalışmalarının tamamlanarak ön klinik çalışmalar öncesi gerekli verilerin belirlenerek ön klinik çalışmalara alınmak üzere ilaç adayı olabilecek bileşiklerin saptanması bu proje kapsamında planlanan faaliyetlerle gerçekleştirilecektir. Proje sonunda ulaşılacak aktif ve optimize edilmiş moleküller ileri ön klinik çalışmalar için değerlendirilebilecektir.