Akademik Veri Yönetim Sistemi
XVI. Uluslararası Katılımlı Metabolik Hastalıklar ve Beslenme Kongresi, Hatay, Türkiye, 28 Mayıs - 01 Haziran 2022, ss.35
SS35
HOMOZİGOT p.L483P MUTASYONUNA BAĞLI GLUKOSEREBROSİDAZ
EKSİKLİĞİNDE FENİLBÜTİRAT, URSODEOKSİKOLİK ASİT, BETAİN VE
PRİMETAMİNİN YENİDEN HEDEFLENEREK İNVİTRO ENZİM AKTİVİTESİNİ
RESTORASYON POTANSİYELLERİNİN İNCELENMESİ
Ayşe Kılıç ¹, Gürsel Biberoğlu ¹, Murat Öktem ¹, Aslı İnci ¹, İpek Işık Gönül ², Sümeyye
Aydoğdu Demirel ¹, Başak Udgu Işık ¹, İlyas Okur ¹, Leyla Tümer ¹, Fatih Ezgü ¹
1. Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı, Çocuk
Metabolizma ve Beslenme Bilim Dalı
2. Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Patoloji Anabilim Dalı
GİRİŞ ve AMAÇ
Gaucher hastalığı; GBA genindeki mutasyonlar nedeniyle beta-glukoserebrosidaz enzim
eksikliğinden kaynaklanan bir lizozomal depo hastalığıdır. Beta glukoserebrosidaz enzim
eksikliği sonucunda özellikle retiküloendoteliyal sistemde olmak üzere birçok dokuda
glukozilseramid (Gb1) ve onun deaçile formu olan glukozilsfingosin (Lyso-Gb1) birikimi
görülmektedir. Tip 1 Gaucher Hastalığı non-nöronopatik, Tip 2 akut nöronopatik ve Tip 3
subakut/kronik nöronopatik form olarak tanımlanmaktadır (1,2,3). Gaucher Hastalığının
tedavisinde 1990’lı yıllardan bu yana çeşitli enzim resplasman tedavileri kullanılmaktadır.
Fakat enzim replasman tedavilerinin kan beyin bariyerini geçememesi nedeniyle nöronopatik
formlarda merkezi sinir sistemi bulgularına etkisiz olduğu bilinmektedir. Onaylı substrat
redüksiyon tedavileri enzim replasman tedavisi alamayan veya hafif olgularda
kullanılabilmekle birlikte, nörolojik bulgulara etki etmemektedir (4). Günümüzde pek çok
genetik hastalıkta küçük molekül ve özellikle moleküler şaperon tedavi çalışmaları mevcut
olup bunların büyük bir kısmını lizozomal hastalıklar oluşturmaktadır (5). Şaperonlar, belirli
mutasyonlar sonucu katlanması bozulmuş enzimleri yeniden katlayarak uzaklaştırılmasını
engellemekte ve tekrar lizozoma yönlenmesini ve aktivite göstermesini sağlamaktadır (6,7).
Bu çalışmada ilk kez; kronik nöronopatik tip Gaucher Hastalığı’na yol açtığı bilinen
homozigot p.L483P mutasyonu taşıyan bir hastadan alınan fibroblast kültüründe; kan-beyin
bariyerini aştığı bilinen ve onaylı olarak başka endikasyonlarda kullanılan dört kimyasal
şaperonun beta-glukoserebrosidaz enzimini iyileştirme potansiyeli araştırılmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Deri fibroblastları; %10 FBS, 100 U/ml penisilin, 100 µg/ml streptomisin ve 2,5 µg/ml
amfoterisin B içeren DMEM besi yeri içinde 37 ̊C derece ve %5 CO₂’de kültüre edildi.
Çalışmada; kimyasal şaperon olarak, daha önce farklı endikasyonlarla ruhsatlanmış, kanbeyin bariyerini aşabilen ve şaperon etkileri Gaucher dışında farklı hastalıklarda in vitro
olarak denenmiş olan fenilbütirat, ursodeoksikolik asit, primetamin ve betain etkileri
araştırıldı. Literatürde etkili olduğu bilinen dozlar yeniden düzenlenerek her bir ilaç için dört
farklı doz belirlendi.
Hücreler 72 saat boyunca fenilbütirat 0,1 - 0,5 - 2,5 - 5 mM, ursodeoksikolik asit 5 - 10 - 25 -
50 µmol/L, betain 10 - 25 – 50 - 100 mM, primetamin 0,1 - 0,25 - 0,5 - 1 µg/ml
konsantrasyonlarında inkübe edildi. Bu süre içinde 24 saat aralıklarla besi yeri değiştirilerek
ilaç uygulamaları tekrarlandı.72 saat sonunda tripsinizasyon ile hücreler izole edilerek
glukoserebrosidaz aktivitesi, glukozilsfingosin düzeyleri ile hücre içi lizozom ve
glukoserebrosidaz boyama çalışmaları yapıldı.
XVI. Uluslararası Katılımlı Metabolik Hastalıklar ve Beslenme Kongresi / 28 Mayıs - 01 Haziran 2022
BULGULAR
Fenilbütiratın 0,1 mM dozu ile fibroblastların enzim aktivitesinde %3 artış gözlenirken,
ursodeoksikolik asitin 5 ve 25 µmol/L dozları ile %20 artış gözlendi. Ayrıca fenilbütiratın
artan dozları ile glukozilsfingosin düzeylerinde kademeli olarak % 20-40 ve 5 mM dozu ile de
% 80’e varan azalma gözlendi. Glukozilsfingosin düzeylerinde ursodeoksikolik asit 10
µmol/L dozu ile %75 düşüş saptandı. Western blot, real time PCR ve hücre içi boyama
çalışmaları devam etmekte olup etkisi gözlenen kimyasal şaperonlar ile nöronal hücre, hayvan
ve klinik araştırma çalışmaları planlandı.
TARTIŞMA ve SONUÇ
Bu çalışmada GBA geninde homozigot p.L483P mutasyonununa bağlı glukoserebrosidaz
eksikliği bulunan fibroblastlarda kimyasal şaperon in vitro enzim restorasyonu hedeflenmiştir.
Çalışma sonucunda özellikle fenilbütirat ve ursodeoksikolik asit ile enzim aktivitesinde
önemli ölçüde artış ve LysoGb1 düzeylerinde azalma saptanmıştır. Bu veriler ile protein ve
ekspresyon analizleri ile lizozomal hedefleme boyama çalışmaları planlanmıştır. Bu
sonuçlardan sonra klinik araştırma gerçekleştirilecek ve nörolojik tutulum ile seyreden
Gaucher hastalarına yeni bir tedavi olanağı sunulması hedeflenecektir.
ANAHTAR KELİMELER
Gaucher Disease Type 3, Gaucher Hastalığı Tip 3, molecular chaperone