Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Gazi Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2011
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Bahar Küçükoğlu
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Oositlerde sitoplazmik olgunlaşma ve oosit aktivasyonu ile oosit çekirdeğinin olgunlaşması arasında doğrudan bir ilişki vardır. Kümülüs hücrelerinin bu süreçteki rolü ise oositte protein sentezini uyararak oosit olgunlaşması sürecine katkıda bulunmaktır. Ancak olgun (metafaz II ) bir oositin fertilizasyon kapasitesi olduğu düşünüldüğünde kümülüs hücrelerinin oosit üzerindeki olgunlaştırıcı ve aktifleştirici rolü çok daha iyi açığa çıkmaktadır. Endoplazmik retikulum, hücrenin hayatta kalmasında ve işlevlerini yerine getirmesi için gerekli role sahip bir organeldir. ER hücre içi kalsiyum dengesini ayarlamakta, protein sentezi ve homeostaziyi düzenlemekte ve lipit biyosentezini sağlamaktadır. Hücredeki protein sentezi ve transportundaki rolünden dolayı , 78 kDA GRP78 , GRP94 ve kalretikülin gibi kalsiyum bağımlı moleküler şaperonlardan zengindir. Bu şaperonlar protein katlanmasını sağlayan aracı molekülleri stabilize eder. Birçok faktör katlanamayan proteinlerin ER lümeninde birikmesine neden olur. Bu katlanamayan proteinlerin ER lümeninde birikmesi evrimsel olarak oldukça iyi korunmuş olan katlanmayan proteinlere yanıt yolağını UPR (Unfolding Protein Response) tetikler. Hücrede ER stresiyle tetiklenen UPR nin etkileri 3 grupta toplanır: Adaptasyon, Uyarı, Apopitoz. Hipoksi ve oksidatif ajanların neden olduğu hücresel redoks yolunun bozulması ER lümenindeki disülfit bağlarının ortadan kalkmasına ve proteinlerin katlanamamasına ya da yanlış katlanmasına neden olur. Ġn vitro fertilizasyon tekniklerinden yararlanmak üzere başvuran hasta populasyonlarında folikül stimülasyonlarına bağlı olarak yanıt veren 3 farklı hasta grubu gözlenmektedir. Bunlar arasında normal stimülasyon gösterenler birinci grubu, hipostimülasyon gösterenler ikinci grubu, hiperstimülasyon gösterenler üçüncü grubu oluşturmaktadır. 35 yas altı IVF hastalarında folikül sitimülasyonuna yanıt toplanan oosit sayısının 10 ile 20 arasında olması normostimülason olarak kabul edilmektedir. Buna karşılık aynı doz uyarıya 30 ve üzerinde oosit toplanması hiperstimülasyon sendromu olarak kabul edilirken bu grup hastalara polikistik over sendromuda girmektedir. 6 ve daha az oosit toplanması ise hipostimülasyon olarak kabul edilmektedir. Her üç grupta gerek folikül gelişimi açısından gerekse toplanan olgun oosit (MII) sayısı veya olgun olmayan (PI (GV) veya MI) oosit sayısı açısından anlamlı farklılıklar göstermektedir. Bu çalışmada ovulasyon indüksiyonuna farklı yanıt veren hastalarda ortaya çıkabilecek ER stresine bağlı UPR nin düzenlenmesi incelenmiştir. UPR yolağının başlıca regülatör proteini olan GRP78 in protein seviyesi Western Blot yöntemiyle analiz edilmiştir. GRP78 protein seviyeleri gruplar arasında anlamlı bir değişim gözlenmedi . Diğer taraftan, hiporisponsif hastaların kümülüs hücrelerinde diğer guruplara kıyasla 2 kat daha yüksek GRP78 protein seviyesi saptadık. ER stresini mRNA düzeyinde incelemek için XBP1 ve sXBP1 mRNA seviyeleri RT PCR yöntemiyle incelenmiştir. Bizim çalışmamızda tüm form XBP1 mRNA nın içinde XBP1s mRNA nın miktarı , diğer gruplarla kıyaslandığında, sadece hiporisponsif hastalarda artış göstermiştir. Bu sonuç GRP78 için bulduğumuz sonuçla benzerlik göstermektedir. Ve bizim hiporisponsif hastalarda saptadığımız artmış ER stresinin veya bozulmuş protein katlanma mekanizmasının bu hastalarda folikülogenez ve oosit olgunlaşmasını önemli derecede etkileyeceği hipotezimizi desteklemektedir. Kümülüs hücreleri hücre kültürüyle çoğaltılıp UPR yolağı inhibitörü olan TUDCA ve ER stresi uyaranı tunikamisin ile muamele edilip proliferasyon ve apopitoz indeksleri MTT ve TUNEL yöntemleriyle belirlendi. Kümülüs hücre kültürü yaptıktan sonra kümülüs hücrelerini UPR yolağı inhibitörü TUDCA ve ER stresi uyaranı tunikamisin ile birlikte 48 saat muamele ettik.Hücre canlılığını saptamak amacıyla MTT analizi yapıldı. MTT proliferasyon analizi bulgularımıza göre tunikamisinle indüklenen ER stresiyle UPR nin aktifleşmesi sonucunda kümülüs hücre proliferasyonu baskılanmaktadır. Kümülüs hücrelerine TUDCA ve tunikamisin birlikte uygulayarak ER stresini baskıladığımızda ise hücre proliferasyonunda tunikamisin uygulanan gruba kıyasla bir miktar artış gözledik. MTT analizi sonucunda tunikamisin ile ER stresi uyarılan kümülüs hücrelerinde anlamlı düzeyde azalan hücre proliferasyonuna proliferasyondaki azalma mı yoksa artan apopitozla mı ilişkili olup olmadığını belirlemek amacıyla kümülüs hücrelerinde ER stresini tunikamisin ile indükleyerek apopitoz indeksleri saptanarak kontrol grubu ile kıyaslandı. TUNEL yöntemi sonucunda tunikamisin uygulamasının kümülüs hücrelerinde kontrol grubuna kıyasla apopitozu anlamlı derecede arttırdığı gözlendi. Bu bulguda bize MTT analizinde belirlediğimiz ER stresinin baskıladığı hücre proliferasyonunun büyük olasılıkla azalan proliferasyonla değil artan apopitozdan kaynaklandığını göstermektedir. IVF tedavisine verdikleri yanıta ve klinik bulgularına dayanarak, oosit sayısına bağlı olarak hastalar normostimülasyon , polikistik over sendromu, hiperstimüle ve hipostimüle olarak 4 farklı grupta incelendiler.Hasta grupları yaşlarına göre istatistiksel olarak analiz edildiğinde guruplar arasında anlamlı bir fark bulunamadı . Hasta grupları toplanan ortalama oosit sayısı açısından değerlendirildiğinde PKOS ve hiperstimüle hasta grupları, normal ve hipostimüle hasta gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha fazla oosite sahipti. Ayrıca normal hasta grupları hipostimüle, hasta gruplarına göre anlamlı olarak daha fazla oosit sayısına sahipti. Bu çalışmayla litaretürde ilk kez insan ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde ER aracalı sinyal yolağı ve molekülleri GRP78, XBP1 ve sXBP1 bulunduğunu gösterdik . Kümülüs hücrelerinin ER stres ilişkili sinyal yolağına maruz kaldıklarında hücre proliferasyonunda azalmaya ve/veya apopitozda artışa gidebileceğini gösterdik.IVF tedavisine maruz kalan hastalardan hiporisponsif ( hiperstimüle) grup oluşturan hastaların ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde artmış ER stresinin olduğunu ve bu stresin mRNA düzeyinde sXBP1 ile gösterdik. Son olarakta bu çalışmanın tüm sonuçları sağlıklı bir folikülogenez ve kaliteli bir oosit elde edebilmek için ER stres ve UPR sinyal yolağının fizyolojik sınırlar içerisinde tutulması gerektiğini ve ayrıca hiporisponsif hasta gruplarında patolojik Er stres seviyesini azaltacak ajanların kullanılmasıyla yeni bir tedavi yaklaşımı öngörülebilineceğini önermekteyiz.