Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Gazi Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2018
Öğrenci: ÖZGE ATCI
Danışman: KANUNİ BARBAROS BALABANLI
Özet:APC kolorektal kanserlerin gelişimindeki temel tümör baskılayıcı gendir. Bu mutasyonlar, tümör baskılayıcı APC geninde fonksiyon kaybına neden olarak Wnt yolak aktivasyonuna sebep olur. CRISPR/Cas9 sistemi genomda spesifik bölgelerin hedeflenmesine imkân tanıyan popüler bir genom düzenleme aracıdır. Bu çalışmanın amacı Apc genini CRISPR/Cas9 sistemi ile hedefleyerek kılavuz RNA'nın etkinliğini test etmek ve Apc mutasyonun C2C12 fare miyoblast hücre hattındaki etkilerini araştırmaktır. Araştırmada pX330 ekspresyon plazmidinin içerisine hedef Apc gen dizisinin 16. ekzonunda bulunan GTCTGCCATCCCTTCACGTTAGG (AGG dizisi PAM sekansı) kılavuz RNA dizisi klonlanmıştır. Sekanslama ile doğrulanan pX330-Apc plazmidi ve reporter olarak kullanılan pEGFP plazmidi endo-toksinsiz midiprep yöntemiyle çoğaltılmıştır. Elektroporasyonla C2C12 miyoblast hücreleri transfekte edilmiş ve transfeksiyondan 24, 48 ve 96 saat sonra DNA izolasyonu yapılarak hedef alınan bölge PCR ile çoğaltılmıştır. Pürifikasyon sonrası T7 Endonükleaz I ve Sanger sekanslama ile örnekler mutasyon varlığı açısından değerlendirilmiştir. Kalan transfekte hücreler 14 gün idame ettirilerek morfolojik özellikleri incelenmiş ve hücrelere Oil Red O boyaması yapılmıştır. pEGFP ve pX330-Apc plazmidi ile transfeksiyon sonrası C2C12 hücrelerinde yeşil floresan protein ifadesi tranfeksiyondan 48 saat sonra belirginleşmiştir. pX330-Apc plazmidi ile transfekte edilen C2C12 hücrelerinde Apc gen bölgesinde mutasyon oluşturulduğu Sanger sekanslama ile 48 ve 96 saatten sonra görülmüştür. 14 gün idame ettirilen transfekte hücrelerin sitoplazmalarında mikrovakuoller izlenmiş ve Oil Red O boyamasında sitoplazmik mikroveziküler yapıda biriken materyalin yağ olduğu gözlenmiştir. Bu tez çalışması sonucunda CRISPR/Cas9 sistemi ile fare hücrelerinde seçilen kılavuz RNA test edilmiştir. Ayrıca C2C12 hücrelerinde Apc geninin inaktivasyonu hücrelerin yağlanmasına neden olmuştur. Bulgular Wnt sinyal yolağı ile adipojenez arasında bir ilişki olabileceğini düşündürmektedir.