Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Gazi Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2014
Öğrenci: SEDA ÖZDEN
Danışman: ELİF LOĞOĞLU
Özet:Bu çalışmada topraktan izole edilen Bacillus subtilis (RSKK-11014)ten proteaz enzimi saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Proteaz enzimi üretimi %1,25 glukoz, %1 pepton, % 0,5 maya ekstraktı içeren besiyerinde 37 oC de 24 saat sürede gerçekleştirilmiştir. Proteaz enzimi; %85 (NH4)2SO4 çöktürmesinden sonra DEAE selüloz anyon değişim kromatografisiyle %5,66 verimle 10,42 kat, Sefaroz 4B-basitrasin afinite kromatografisiyle %7,19 verimle 14,07 kat saflaştırılmıştır. Enzimin molekül kütlesi; Doğal (Native)-PAGE ile yaklaşık 36 kDa olarak bulunmuştur. Enzimin optimum sıcaklığının ve pHının sırasıyla 50 oC ve 9,5 olduğu tespit edilmiştir. Enzim 40 oC de 3 saat boyunca aktivitesini korumuştur fakat 60 oC ve 70 oC gibi yüksek sıcaklıklarda aktivitesini çok çabuk kaybettiği görülmüştür. Enzim aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde Ca+2, Co+2, Ni+2 iyonları varlığında aktivitesinin arttığı gözlenirken, Al+3, Cu+2, K+ iyonlarının inhibitör etkisi gösterdiği belirlenmiştir. Fe+3, Mg+2 ve Na+2 iyonları varlığında ise enzimin aktivitesini koruduğu gözlenmiştir. Enzimin aktivitesinde etanol ve n-bütanol çözeltileri ile artış gözlenmiştir ancak benzen, toluen, DMSO çözeltilerinde sırasıyla yaklaşık olarak %15, %15 ve %25 şeklinde aktivite kaybı olmuştur. Metanolde ve asetonda ise aktivitesini korumuştur. Enzimin yüzey aktif maddelere ve yükseltgenlere karşı kararlılığını genel olarak koruduğu ancak yüzey aktif bir madde olan SDS varlığında aktivitesinin yaklaşık %48'ini kaybettiği görülmüştür. Enzim; kazein, jelatin, keratin, ovalbumin, soya fasulyesi unu gibi doğal substratlar karşısında en yüksek aktiviteyi kazein substratına karşı göstermiştir. Enzim, karakteristik serin inhibitörü olan PMSF (fenilmetilsülfonilflorür) ile inhibe olmuştur. 2 mM lık EDTA varlığında aktivitede görülen %48'lik kayıp ise enzimin metal bağlama bölgesine sahip olduğunu göstermiştir. Bu inhibisyon profili, bu proteazın serin proteaz sınıfında olduğunu göstermiştir. Enzimin Lineweaver-Burk grafiğinden yararlanılarak tespit edilen Km ve Vmak değerleri sırasıyla 0,37 mg/ml ve 1,13 μmol. ml-1. dk-1 olarak elde edilmiştir.